Identificação Bioquímica de Bacilos Gram Negativos Entéricos

Identificação Bioquímicade Bacilos Gram Negativos Entéricos

Após o recebimento da amostra coprocultura as bactérias devem ser semeadas em meios seletivos e também pode ser feito um cultivo em caldo nutritivo. Para iniciar o TSI devemos usar colônias bem isoladas.

TSI (Triplice Sugar Iron)

Meio nutricionalmente rico com inibidores que permite o crescimento da maioria das espécies bacterianas, só não cresce as mais exigentes e anaeróbios.
O TSI só pode ser realizada com amostras já isoladas em placas com meio seletivo para bacilos gram negativos entéricos. O indicador de pH é vermelho de fenol (pH ácido indicador fica amarelo; pH alcalino o indicador fica vermelho).Um ponto importante é a proporção entre os açucares sendo que esse meio apresenta a proporção de Glicose : Lactose : Sacarose 1:10:10 (g/L), há também tiossulfato de sódio, sulfato ferroso e peptona.

Fermentação dos Açucares

Produção de H2S

Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela ira degradar o tiossulfato de sódio presente no meio produzindo H2S, este reage com o sulfato ferroso formando um precipitado preto de sulfeto ferroso. Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido, assim se a base do tubo estiver negra deve ser lida como que a bactéria é fermentadora de glicose.

Produção de Gás

Há bactérias que degradam o ácido fórmico proveniente da fermentação da glicose produzindo H2 ;CO2 devido a ação da enzima formiase. A produção de gás é evidenciada pela formação de bolhas e ou o meio pode rachar. Se houver muita produção de gás com o deslocamento do meio pode seer indicativo de Klebsiela e Enterobacter.

Para prosseguir com as outras provas Bioquímicas devemos usar as colônias de bactérias que cresceram na parte superior do TSI. Entretanto devemos ter certeza que no TSI só tem uma espécie, isso é obtido a partir de meios seletivos e caldos nutritivos.

Indol

O indol é produzido a partir do tríptofano existente no meio de cultura sob a ação da triptofanase, há também a produção de ácido pirúvico e amônia.
O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa “pink” na parte superior do tubo após a adição p-dimetilaminobenzaldeído (reativo de kovacs).

VM (Vermelho de Metila)

Teste que avalia se as bactérias que fermentam a glicose pela via ácida mista, com isso há a produção de vários ácidos (ácido fórmico, lático, acético) que faz com que o pH do meio fique abaixo de 4,4 que é o limite de viragem do indicador de pH.
O indicador de pH é o vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo.

VP (Voges Proskauer)

Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica, fermentam a glicose produzindo acetil-metil- carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos.Quando é adicionado KOH e na presença de O2 atmosférico a acetoína é convertida em diacetila a adicição de alfa-naftol nesta reação cataliza a produção de um anel vermelho.

Citrato

Este teste determina se a bactéria é capaz de o citrato de sódio como única fonte de carbono para o seu metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, composto por citrato de sódio, fosfato de amônia e por azul de bromo fenol.Com o uso de citrato há a produção de hidróxido de amônia que eleva o pH fazendo que a reação se torne azul.

Urease

Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a coloração “pink”.

Fenilalanina Desaminase (FAD)

Há bactérias que produzem enzimas que desaminam a fenilalanina presente no meio, originando o ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico adicionado ao meio, desenvolvendo cor verde.Essa prova é presuntiva para Proteus, Morganela, Providencia.

Lisina descarboxilase(LDC)

Há algumas bactérias que possuem a lisina descarboxilase que descorboxila a lisina produzindo a cadaverina mais CO2, essa descaroboxilização alcaliniza o meio.O meio contém o indicador azul de bromocresol, que em pH alcalino apresenta-se em cor roxo e em meio ácido a cor amarela. A reação se processa em anaerobiose deve-se cobrir o meio com óleo mineral ou cera de carnúba.

Mio (Motilidade, Indol e ornitina)

Se a bactéria produz a enzima ornitina descarboxilase, ela será capaz de descarboxilar a ornitina produzindo gás carbônico e putrecina, isso eleva o pH do meio. O indicador de pH usado é o púrpura de bromocresol que e, condições alcalinas se torna roxo. É útil para diferenciar entre Klebsiella (negaivo) e Enterobacter (positivo).

A produção de Indol pode ser detectado colocando um papel filtro ou algodão umedecido com reativo de indol, na aula prática o indol foi feito separado para que ficasse de forma mais didática.
A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre do fato que o meio é semi-sólido e permite o crescimento bacteriano por todo o tubo. Se a motilidade é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que motilidade negativa só observaremos a picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra um folha de papel pautada, se conseguirmos observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.

Fonte: http://bioinfo-aula.blogspot.com/2007/12/identificao-bioqumica-de-bacilos-gram.html